נערך על ידי פיטר סרנוב, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת סטנפורד, אוניברסיטת סטנפורד, קליפורניה, אושר ב-25 בדצמבר 2020 (נבדק ב-25 באוקטובר 2020)
אנו מדווחים על האינטראקציה בין תת-יחידות בשכפול של מתחמי קורונה-תעתוק, החיוניים לשכפול ולשימור אבולוציוני.סיפקנו ראיות לכך שלתחום NiRAN הקשור ל-nsp12 יש פעילות טרנספראז של נוקלאוזיד מונופוספט (NMP) בטרנס, וזיהינו את nsp9 (חלבון קושר RNA) כמטרה שלו.NiRAN מזרז את ההתקשרות הקוולנטית של חלק ה-NMP לקצה האמינו השמור של nsp9 בתגובה המסתמכת על יוני Mn2+ ושאריות Asn שמורות סמוכות.נמצא שפעילות NiRAN ו-nsp9 NMPylation חיוניים לשכפול נגיף הקורונה.הנתונים מאפשרים לנו לקשר את הפעילות הזו של סמן האנזים המקונן של הנגיף לתצפיות הקודמות בהשערה כי התחלת סינתזת RNA במחלקה של נגיפי RNA עקבית מבחינה תפקודית ואבולוציונית.
ה-RNA פולימראז התלוי ב-RNA (RdRps) של Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae ו-12 משפחות נוספות) מקושר לתחום האמינו-טרמינלי (N-terminal) בחלבון הלא מבני (nsp) המשתחרר מהפוליפרוטאין, הנקרא NiRAN 1ab מורכב מפרוטאז ראשי ויראלי (Mpro).בעבר, דווח על פעילות GMPylation/UMPylation של נגיף העורקים NiRAN-RdRp nsp עצמו, והוצע ליצור חולף להעברת נוקלאוזיד מונופוספט (NMP) לוירוס (לא ידוע כרגע) ו/או ביו-פולימריזציה של התא.כאן אנו מראים שלקורונה (Human Coronavirus [HCoV]-229E ותסמונת נשימה חריפה Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) יש פעילות NMPylation תלוית Mn2+, אשר נגזרת מ-nsp9 דרך היווצרות nsp9 בתיווך Mpro לאחר ה-N-טרמינל האגף nsps משתחרר פרוטאוליטי, הפוספורמידאט נקשר לאמין הראשוני (N3825) ב-N-טרמינל של nsp9.Uridine triphosphate הוא הנוקלאוטיד המועדף בתגובה זו, אך אדנוזין טריפוספט, גואנוזין טריפוספט וציטידין טריפוספט הם גם מצעים משותפים מתאימים.מחקרי מוטציות באמצעות חלבונים רקומביננטיים של נגיף קורונה nsp9 ו-nsp12 ומוטנטים מהונדסים גנטית של HCoV-229E קבעו את השאריות הנחוצות ל-NMPylation nsp9 בתיווך NiRAN ושכפול וירוסים בתרבית תאים.הנתונים אישרו את החיזוי של שיירי אתר פעילים של NiRAN וקבעו את התפקיד החשוב של שיירי nsp9 N3826 ב-nsp9 NMPylation ושכפול וירוסים במבחנה.שייר זה הוא חלק מרצף הטריפפטיד N-טרמינלי השמור והוכח כשריד הבלתי משתנה היחיד של nsp9 וההומולוגים שלו במשפחת הקורונה.מחקר זה מספק בסיס איתן למחקר פונקציונלי של פעילות NMPylation של וירוסים מקוננים אחרים ומציע יעדים אפשריים לפיתוח תרופות אנטי-ויראליות.
נגיף RNA חיובי-גדילי Nidovirales מדביק מגוון של בעלי חוליות וחסרי חוליות (1, 2).הצו כולל כיום 14 משפחות (3), מתוכן משפחת הקורונה נחקרה בהרחבה ב-20 השנים האחרונות.באותה תקופה, שלושה נגיפים זואונוטיים צצו ממארחי בעלי חיים וגרמו להתפרצויות בקנה מידה גדול של זיהומים קשים בדרכי הנשימה בבני אדם.כולל מגיפות מתמשכות הנגרמות על ידי מחלות זיהומיות חריפות קשות.תסמונת נשימתית Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4ââââ7).נידו-וירוס חולקים ארגון גנום משותף, ותת-היחידה של קומפלקס שכפול-תעתוק הממברנה (RTC) מקודדת בשני שליש ה-5-?²-טרמינליים ובתת-היחידה המבנית העיקרית של חלקיק הנגיף, כמו גם כמה אביזרים .חלבון, מקודד בשליש הקצה 3??² של הגנום (1).למעט משפחה אחת של וירוסים מישוריים (Monoviridae) (8), כל הנגיפים המקוננים מקודדים תת-יחידות RTC בשתי מסגרות קריאה פתוחות גדולות (ORF) ORF1a ו-ORF1b, שמתורגמות מ-RNA גנומי של.ORF1a מקודד לפוליפרוטאינים (pp) 1a, ו-ORF1a ו-ORF1b מקודדים יחד ל-pp1ab.עם ההשתתפות הכללית של הפרוטאז הראשי (Mpro) המקודד על ידי ORF1a, הן pp1a והן pp1ab מעובדים בצורה פרוטאוליטית למגוון של חלבונים לא מבניים (nsps), הידועים גם בשם 3CLpro, מכיוון שיש לו הומולוגיה עם 3Cpro של ה-picornavirus ( 9).nsps אלה נחשבים מורכבים ל-RTC דינמי גדול, מזרזים את הסינתזה של RNA גנומי (שכפול) וקבוצה של RNA תת-גנומי (תעתוק), ומשמשים לתאום הביטוי של ORF הממוקם במורד הזרם של ORF1b (10? ? ?12).
הליבה RTC כוללת RNA פולימראז תלוי RNA (RdRp) (13), superfamily 1 helicase (HEL1) (14, 15) וכמה אנזימים לעיבוד RNA, המקודדים בעיקר ב-ORF1b ובמשפחת הקורונה. הוא מכיל nsp12-nsp16 ו nsp9-nsp12 במשפחת Arterioviridae (ראה התייחסות 10ââ 12).RdRp ו-HEL1 מייצגים שני (חמישית) תחומים משומרים של נגיף קן הציפור ויש להם הומולוגיה בין נגיפי RNA אחרים.מאמינים ש-Core replicase נעזר ביחידות משנה אחרות, כולל כמה nsps קטנים המשתחררים מאזור ה-carboxy-terminal (C-terminal) של pp1a, במורד הזרם של Mpro (coronavirus nsp5 ו- arterial virus nsp4, בהתאמה).יש להם הגנה מוגבלת ספציפית למשפחה ופעילויות מגוונות (נסקרו בהפניה 10ââ12).
לאחרונה יחסית, נמצא תחום בעל מאפייני מוטיב רצף ייחודיים בקצה האמינו (N-terminus) הסמוך ל-RdRp בכל הנגיפים המקוננים, אך לא נגיפי RNA אחרים (16).בהתבסס על מיקומו ופעילות הנוקלאוטיד טרנספראז (נוקלאוזיד מונופוספט [NMP] טרנספראז), תחום זה נקרא NiRAN (Nestvirus RdRp-related nucleotide transferase).השילוב הדו-דומיין של NiRAN-RdRp מהווה nsp12 במשפחת Coronaviridae ו-nsp9 במשפחת Arterioviridae, וב-nestoviridae אחרים, NiRAN-RdRp צפוי להשתחרר כ-nsp עצמאי מהפוליפרוטאין הנגיפי.בנגיף הקורונה, תחום NiRAN מכיל ??1/450 שאריות ומחובר לתחום ה-C-terminal RdRp דרך אזור הקישור (16?19).ב-Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae), nsp9 רקומביננטי מציג פעילויות UMPylation ו-GMPylation תלויות יוני Mn2+ (עצמי), התלויות בשלושה בסיסי רצף משומרים ב-nestovirus, AN, BN ו-CN השאריות ברצף.כאשר N מייצג NiRAN) (16).הצד ה-N-טרמינלי של מוטיבים אלה הוא מוטיב פחות שמרני preAN.חלק משאריות אלו נשמרות גם בקינאזות חלבון הקשורות רחוק, שם הוכח שהם מעורבים בקישור לטריפוספט נוקלאוזיד (NTP) ובפעילות קטליטית (20, 21).בהתאם לתצפית זו, ניתן להרכיב מספר שיירי אתר פעילים מרכזיים ב- pseudokinase SelO מ- Pseudomonas syringae עם קומפלקס העל SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 שפורסם לאחרונה.שאריות NiRAN משומרות של נגיף הקורונה מונחות על גבי מבנה האלקטרונים.חלבון רקומביננטי (17).משערים שה-U/GMPylation המתועד (העצמי) ייצור מצב חולף להעברת NMP למצע (לא ידוע כרגע) (16), והדמיון המבני בין NiRAN לבין חלבון קינאז (17, 19) האם ההשערה היא ש NiRAN משנה חלבונים אחרים.
מאפיינים רבים, כולל הקשר השיטתי הייחודי והייחודי שלו עם וירוסים מקוננים והפרדה גנטית מ-RdRp, הופכים את NiRAN לאנזים רגולטורי מרכזי סביר עבור וירוסים מקוננים, שהוא קריטי להופעתם וזהותם.בעבר נקראו שלוש פונקציות אפשריות הכוללות את NiRAN לוויסות תרגום גנום/תת-גנומי או שכפול/שעתוק.כאשר בוחנים את הנתונים הדלים והלא מלאים הזמינים באותה עת, לכל פונקציה יש את היתרונות והחסרונות שלה (16).במחקר זה, אנו שואפים לשלב את המחקרים הביוכימיים והגנטיים ההפוכים של נגיף הקורונה המייצגים את שני הזנים, ולשים את הממצאים שלנו ברקע האבולוציוני של המוטציה הטבעית של משפחת הקורונה, כדי לקבל תובנה על הממלכה המסתורית הזו.אנו מדווחים על התקדמות משמעותית בהבנת NiRAN באמצעות זיהוי מטרות טבעיות ב-RTC, אשר (בין שלוש ההשערות הזמינות) תורם לתפקידו של תחום זה בהתחלת הסינתזה של RNA נגיף מקונן.המחקר הזה גם פותח אפשרויות לתפקידים אחרים של NiRAN בממשק מארח הווירוסים.
על מנת לאפיין את התכונות האנזימטיות של תחום NiRAN הקשור לנגיף הקורונה nsp12, יצרנו צורה רקומביננטית של נגיף קורונה אנושי 229E (HCoV-229E) nsp12 ב-E. coli, עם תג His6 בקצה ה-C, ושילבנו את חלבון עם [α32-P ] דגירה יחד עם NTP בנוכחות MnCl2 כמתואר בחומרים ושיטות.הניתוח של תוצר התגובה הצביע על נוכחות של חלבון מסומן רדיואקטיבי הנודד יחד עם nsp12 (106 kDa), מה שמצביע על כך שנגיף הקורונה nsp12 מזרז יצירת תוספות חלבון קוולנטיות-NMP, שנוצרו באופן מועדף עם אורידין מונופוספט (UMP) (איור 1A) וכן ב).ניתוח כמותי הראה שבהשוואה לנוקלאוטידים אחרים, עוצמת האות של שילוב UMP עלתה פי 2 עד 3 (איור 1C).נתונים אלה עולים בקנה אחד עם הפעילות החזויה של NMP transferase של תחום NiRAN של נגיף הקורונה (16), אך מצביעים על כך שהעדפות הנוקלאוטידים של תחום NiRAN של נגיף הקורונה ושל הנגיף העורקי שונות.
פעילות NMPylation עצמית של HCoV-229E nsp12.(א) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) הודגר עם NTP המיועד [α-32P] בנוכחות 6 mM MnCl2 למשך 30 דקות (ראה חומרים ושיטות לפרטים).תוצרי התגובה הופרדו על ידי SDS-PAGE ונצבעו בכחול מבריק Coomassie.(ב) החלבון המסומן רדיואקטיבי מוצג על ידי הדמיה של זרחן.המיקומים של nsp12-His6 וסמני מסה מולקולרית חלבון (בקילודלטון) מוצגים ב-A ו-B. (C) עוצמת האות הרדיואקטיבי (ממוצע ± SEM) נקבעה משלושה ניסויים בלתי תלויים.*P≤0.05.עוצמת האות (אחוז) קשורה ל-UTP.
למרות שפעילות האנזים הקשורה ל-Niran הוכחה כחיונית לשכפול של EAV ו-SARS-CoV בתרבית תאים (16), הפונקציה הספציפית של NiRAN והמטרות הפוטנציאליות טרם נקבעו.הדמיון המבני שדווח לאחרונה בין NiRAN לבין משפחת חלבונים עם קפלים דמויי חלבון קינאז (17, 22) הניע אותנו לבדוק את ההשערה כי NiRAN מזרז את ה-NMPylation של חלבונים אחרים.יצרנו קבוצה של יעדים הומולוגיים פוטנציאליים, כולל חלבונים לא מבניים המקודדים על ידי HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), כל אחד מכיל תג His6 מסוף C (נספח SI, טבלה S1), וכן דגירה חלבונים אלה עם [α32-P] uridine triphosphate ([α32-P]UTP) בנוכחות או היעדר nsp12.אלבומין בסרום בקר וחלבון היתוך MBP-LacZα המיוצר ב-E. coli שימשו כבקרות (איור 2A, נתיבים 1 עד 7).החלבון המסומן רדיואקטיבי נותח על ידי סודיום דודקיל סולפט-פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) ואוטורדיוגרפיה, ונמצא כי היה אות רדיואקטיבי חזק בתגובה המכילה nsp12 ו-nsp9.המיקום של האות מתאים למסה המולקולרית של nsp9, מה שמצביע על UMPylation בתיווך nsp12 של nsp9 (איור 2B, מסלול 7).לא נמצאו חלבוני בדיקה אחרים כ-UMPylated, מה שהוביל אותנו למסקנה ש-nsp9 הוא מצע ספציפי של nsp12.בהתאם לנתוני ה-NMPylation העצמי המוצגים באיור 1, nsp12 מסוגל להעביר את כל ארבעת ה-NMPs ל-nsp9, למרות שהיעילות שונה, UMP> אדנוזין מונופוספט (AMP)> גואנוזין מונופוספט (GMP)> ציטידין מונופוספט (CMP) ) ( תְמוּנָה).3 א' וב').בתנאים המשמשים בבדיקה זו (קצרו את זמן התגובה והחשיפה, הפחיתו את הריכוז של nsp12; חומרים ושיטות), לא ניתן היה לזהות את ה-NMPylation העצמי של nsp12 (השווה איור 2B, נתיב 7 ואיור 1B), אשר הוכיח כי UMP יעיל (ומספר סיבובים) עבר מ-nsp12 ל-nsp9.פעילות UMP transferase דורשת נוכחות של יוני Mn2+, כפי שמוצג באיור 3C, בעוד שרק פעילות מינימלית של UMP transferase נצפתה בנוכחות Mg2+, וללא פעילות בנוכחות שני הקטיונים הדו ערכיים האחרים שנבדקו.נתונים דומים התקבלו במבחני NMPylation המכילים ציטידין טריפוספט (CTP), גואנוזין טריפוספט (GTP) ואדנוזין טריפוספט (ATP) (נספח SI, איור S1).
HCoV-229E UMPylation בתיווך nsp12 של nsp9.סדרה של מצעי חלבון (כולל אלבומין בסרום בקר, MBP-lacZα וסדרה של HCoV-229E nsps המסומנים ב-C-terminal His6 המקודד על ידי ORF1a) שימשו להערכת פעילות UMPylation של HCoV-229E nsp12-His6⁺-ted חֶלְבּוֹן.דגירה על החלבון עם [α-32P] UTP למשך 10 דקות בהיעדר (A) או נוכחות (B) של nsp12 כמתואר בחומרים ובשיטות.בחלק העליון של A ו-B מוצג ג'ל SDS-polyacrylamide מוכתם ב- Coomassie Brilliant Blue, ובחלק התחתון של A ו-B מוצגות האוטורדיוגרמות המתאימות.המיקום של סמן המסה המולקולרית של החלבון (בקילודלטון) ניתן בצד שמאל.גם המיקום של nsp12-His6 (B, למעלה) והאות הרדיואקטיבי שנצפה במהלך הדגירה של nsp12-His6 עם nsp9-His6 (B, נתיב 7) מסומנים, מה שמצביע על כך ש-[α-32P]UMP ל-nsp9-His6 ( 12.9 kDa), אשר לא נצפה עבור חלבונים אחרים שנבדקו.
HCoV-229E אפיון ביוכימי וויירולוגי בתיווך NiRAN של nsp9 NMPylation.(A ו-B) תפקידו של המצע הנוקלאוטיד המשמש בתגובה.Nsp12-His6 ו-nsp9-His6 מעורבבים ומודגרים בנוכחות של [α-32P] NTPs שונים במבחן NMPylation הסטנדרטי.(א, למעלה) nsp9-His6 מוכתם ב-Coomassie מופרד על ידי SDS-PAGE.(א, למטה) אוטורדיוגרף של אותו אזור של הג'ל.(ב) הפעילות היחסית (ממוצע ± SEM) בנוכחות קופקטור הנוקלאוטיד המיועד נקבעת משלושה ניסויים עצמאיים.*P≤0.05.(ג) תפקיד יוני המתכת.מוצגת בדיקת NMPylation הסטנדרטית בנוכחות [α-32P] UTP ויוני מתכת שונים, כל אחד בריכוז של 1 mM.ב-C, החלק העליון, Coomassie מוכתם nsp9-His6 מוצג, וב-C, התחתון, מוצגת האוטורדיוגרפיה המתאימה.גודל החלבון המסומן (בקילודלטון) מוצג משמאל ל-A ו-C. (D) הצורה המוטנטית של HCoV-229E nsp12-His6 הנושאת את החלפת חומצת האמינו שצוינה נמצאת ב-[α-32P]UTP, כמתואר בחומרים ושיטות.ה-nsp9-His6 המסומן רדיואקטיבי שנוצר בתגובת NMPylation מזוהה על ידי הדמיית זרחון (D, למעלה).הפעילות היחסית בהשוואה לחלבון הבר (wt) מוצגת ב-D, והחלק התחתון נלקח כממוצע (±SEM) משלושה ניסויים עצמאיים.כוכביות מצביעות על החלפות של שאריות לא משומרות.(ה) טיטר הנגיף בסופרנטנט התרבותי של תאי p1 שהושג 24 שעות לאחר ההדבקה נקבע על ידי בדיקת פלאק.החלפות הקודון בדומיין NiRAN של המוטנט המהונדס HCoV-229E מסומנים (מספור השאריות מבוסס על מיקומם ב-pp1ab).המוטנט nsp12_DD4823/4AA באתר הפעיל RdRp חסר שכפול שימש כבקרה.
על מנת לקבל הבנה מעמיקה יותר של האתר הפעיל של NiRAN ולקבוע את השאריות הקשורות לפעילות של NMP טרנספראז ספציפי ל-nsp9, ביצענו ניתוח מוטציות, שבו החלפנו את השאריות השמרניות במוטיבים של NiRAN AN, BN ו-CN ( 16) זה עלא (נספח SI, איור S2).בנוסף, ההשפעה של החלפות Arg-to-Lys או Lys-to-Arg שמרניות הוערכה בשני מקרים.כבקרה (שלילית), שיירים שלא או פחות נשמרים בתחום NiRAN של נגיפים וירוסים מקוננים אחרים מוחלפים ב-Ala. החלפת K4116A (במוטיב preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (מוטיב BN) ו-D4280A (CN) מפחיתים באופן משמעותי או אפילו מבטל את NMPylation של nsp9 דרך nsp12, בעוד שחלבונים עם החלפות שמרניות (R4178K), K4116R) שומרים על 60% ו-80% מהפעילות שלהם, מה שמעיד על הרפיה של ההגבלות בצד שלהם. שרשראות רגישות מבחינה פיזיקוכימית (איור 3D).החלפת מספר שאריות שמורות אחרות E4145A, D4273A, F4281A ו-D4283A היא הרבה פחות מזיקה, ו-nsp9 UMPylation מופחת רק באופן מתון.תוצאות דומות התקבלו בתגובות nsp9 NMPylation הכוללות NTPs אחרים (איור 3D ו-SI נספח, איור S3), המאשרות שההשפעות שנצפו על החלפות חומצות אמינו ספציפיות אינן תלויות בסוג המצע המשותף של נוקלאוטידים בשימוש.לאחר מכן, בדקנו את ההשפעה האפשרית של תחליפי nsp12 אלה על שכפול של נגיפים בתרבית תאים.לשם כך, השתמשנו בתבניות DNA משלימות (cDNA) מתאימות מהונדסים גנטית המשובטים בנגיף vaccinia רקומביננטי (23, 24) כדי לתמלל 5 -7 תאים.טיטרציה של צאצאי וירוסים זיהומיים המיוצרים בתאים אלה הראתה שרוב המוטנטים של HCoV-229E NiRAN לא היו אפשריים (איור 3E).קבוצה של מוטנטים ויראליים שאינם ברי קיימא כוללת חלופות שהוכחו כמבטלות או מפחיתות באופן משמעותי את פעילות NMP transferase במבחנה (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), אך קיימות שתי חלופות אחרות (K4116R, E4145A) % שמורות?פעילות ה-NMPylation במבחנה שלהם מעידה על כך שמעורבות בה הגבלות נוספות.באופן דומה, שתי מוטציות אחרות (R4178K, F4281A) שגרמו לירידה מתונה בפעילות ה-NMPylation חוץ גופית של NiRAN יצרו וירוסים חיים, עם זאת, וירוסים אלה הפחיתו באופן משמעותי את הטיטרים באמצעות שכפול.בהתאם לנתוני הפעילות החוץ-גופית המוצגים באיור 3D, החלפת ארבעה שיירים אחרים שאינם נשמרים בנגיף הקורונה ו/או נגיפים מקוננים אחרים (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) יצרו וירוסים בני קיימא. הצאצאים, למרות שיש להם טיטר מופחת באופן מתון בהשוואה לנגיף הפראי (איור 3E).
על מנת לחקור אם פעילות NMP טרנספראז בתיווך NiRAN תלויה בתחום ה-RdRp הפעיל, שני שיירי ה-Asp המשמרים המעורבים בתיאום של יוני מתכת דו-ערכיים (11) במוטיב C של RdRp הוחלפו ב-Ala. החלבון שנוצר nsp12_DD4823/4AA שומר פעילות ה-nsp9 NMPylation שלו, המצביע על כך שפעילות nsp9 NMPylation במבחנה בתיווך nsp12 אינה דורשת פעילות פולימראז (נספח SI, איור S4).
לאחר ביסוס פעילות NMP transferase הספציפית ל-nsp9 עבור nsp12, ניסינו לאפיין את התוספת NMP-nsp9 על ידי ספקטרומטריית מסה (MS).ספקטרום מסת החלבון המלא של HCoV-229E nsp9 רקומביננטי הראה שיא של 12,045 Da (איור 4A).התוספת של nsp12 לא שינתה את האיכות של nsp9, מה שמצביע על כך ש-nsp12 ו-nsp9 לא יהוו קומפלקס יציב בתנאים שבהם נעשה שימוש (דנטורציה) (איור 4A).בנוכחות UTP ו-GTP, מדידת המסה של התגובה המכילה nsp9 ו-nsp12 בהתאמה הראתה שמסת החלבון של UTP זזה 306 Da, ומסת החלבון של GTP זזה 345 Da, מה שמצביע על כך שכל מולקולת nsp9 קושרת UMP או GMP (תמונה 4) ג' ו-ד').משערים שהאנרגיה הדרושה ל-NMPylation של nsp9 בתיווך NiRAN מגיעה מהידרוליזה של NTP ושחרור פירופוספט.למרות שעודף טוחני של פי 10 של nsp9 (מטרה) מאשר nsp12 (אנזים) שימש בתגובה זו, נצפתה NMPylation כמעט מוחלט של nsp9, מה שמצביע על כך שהאינטראקציה בין nsp12 ל-nsp9 היא קצרת מועד, ו-nsp12 יכול NMPylate יותר nsp9 מולקולה במבחנה.
NMPylation יחיד של nsp9 בנוכחות nsp12 ו-UTP או GTP.מוצג ספקטרום מסת החלבון המלא המפותל של HCoV-229E nsp9 (נספח SI, טבלה S1) (AD).(א) nsp9 לבד, (ב) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 בנוכחות UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 בנוכחות GTP.
כדי לקבוע את שאריות ה-nsp9 שעברו UMPylated על-ידי nsp12, nsp9-UMP נבקע עם טריפסין.הפפטידים שהתקבלו הופרדו על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ננו-גבוהה (HPLC) ונותחו באמצעות ספקטרומטריית מסה טנדם (MS/MS) באינטרנט.ניתוח נתונים באמצעות חבילת התוכנה Byonic (Protein Metrics) הראה UMPylation של חומצת האמינו ה-N-טרמינלית.זה מאושר באופן ידני.ספקטרום המסה הטנדם של הפפטיד המבשר [UMP]NNEIMPGK (נספח SI, איור S5A) חשף שבר במהירות של 421 מ"צ, המצביע על כך ש-UMP נקשר לשייר 1 של nsp9.
בקצה ה-N של nsp9, Asn נשמר בין חברי Orthocoronavirinae (נספח SI, איור S6).למרות שאנו מאמינים שחנקן אמין ראשוני N-טרמינלי הוא המקובל הסביר ביותר עבור UMP, החלטנו להשיג ראיות נוספות לקשירת NMP במסוף N.מסיבה זו, הפפטיד N-טרמינלי ללא NMPylated ו-NMPylated nsp9 שטוהר על ידי HPLC נגזר בנוכחות אצטון ונתרן ציאנובורוהיריד.בתנאים אלה, ניתן לשנות רק אמינים ראשוניים חופשיים עם פרופיל (25).הפפטיד N-terminal nsp9 שמקורו ברצף NNEIMPGK מכיל שני אמינים ראשוניים, אחד בקצה N של Asn והשני בשרשרת הצדדית של Lys בקצה C.לכן, ניתן להכניס קבוצות פרופיל בשני הקצוות.כרומטוגרמות היונים המופקות של פפטידים שאינם NMPylated מוצגות בנספח SI, איור S5B.כצפוי, ניתן לזהות פפטידים N-טרמינליים ו-C-טרמינליים (מונו) פרופטידים (נספח SI, איור S5B, נתיב עליון) ודי-פרופיל (נספח SI, איור S5B, נתיב תחתון).דפוס זה משתנה עם השימוש בפפטיד NMPylated N-terminal של nsp9.במקרה זה, ניתן לזהות רק פפטידים פרופטידים בקצה C, אך לא ניתן לזהות פפטידים פרופטידים עם קצה N-טרמינלי ופפטידים דיפרופילטיים (נספח SI, איור S5C), מה שמצביע על כך ש-UMP הועבר לאמין הראשוני במסוף N כדי למנוע זאת. הקבוצה מביצוע שינויים.
לאחר מכן, אנו מחליפים (ב-Ala או Ser) או מוחקים את השרידים השמורים בקצה ה-N של nsp9 כדי להגדיר אילוצים ספציפיים ליעד.בהתבסס על נתוני הטרשת הנפוצה שלנו, המראים שניראן יוצר תוספת nsp9-NMP עם האמין הראשוני של השארית ה-N-טרמינלית של nsp9, שיערנו ש-nsp9 NMPylation דורש מהפרוטאז המאסטר הנגיפי (Mpro, nsp5) לשחרר את ה-nsp9 N-terminal מ-nsp9 מבשר הפוליפרוטאינים שלו.כדי לבדוק השערה זו, הפקנו חלבון מבשר nsp7-11 המכיל nsp9 ב-E. coli וביצענו בדיקת NMPylation סטנדרטית בנוכחות [α-32P] UTP (חומרים ושיטות).כפי שמוצג באיור 5A (מסלול 3), מבשר ה-nsp7-11 הלא חתוך אינו מסומן באמצעות nsp12.לעומת זאת, אם nsp7-11 מבוקע על ידי nsp5 רקומביננטי לשחרור nsp9 (ו-nsps אחרים) מהמבשר, מזוהה חלבון מסומן רדיואקטיבי הנודד עם nsp9, מה שמאשר את מסקנתנו כי NiRAN ו-N- היווצרות סלקטיבית של תוספות nsp9-NMP קוולנטיות .האמין הראשוני הטרמינל של ה-N-טרמינל Asn (מיקום 3825 ב-pp1a/pp1ab).מסקנה זו נתמכת גם על ידי ניסויים המשתמשים במבנה nsp9, המכיל שייר אחד או שניים נוספים בקצה ה-N.בשני המקרים, UMPylation בתיווך NiRAN של nsp9 בוטל (נספח SI, איור S7).לאחר מכן, הפקנו חלבון עם שיירי Asn אחד או שניים שנמחקו מרצף הפפטידים 3825-NNEIMPK-3832 ב-N-terminal של nsp9.בשני המקרים, UMPylation של nsp9 נחסם לחלוטין (איור 5B), ומספק ראיות נוספות לכך שה-N-terminus האמיתי של nsp9 פועל כקולטן NMP.
העיבוד הפרוטאוליטי של nsp9 והתפקיד של שאריות N-טרמינליות ב-UMPylation בתיווך nsp12.(א) nsp9 UMPylation דורש nsp9 N-טרמינל חופשי.Nsp7-11-His6 מודגרת מראש ב-30 מעלות צלזיוס במאגר זיהוי NMPylation המכיל UTP בנוכחות או בהיעדר Mpro רקומביננטי (nsp5-His6).לאחר 3 שעות, התחל את מבחן NMPylation על ידי הוספת nsp12-His6 כמתואר בחומרים ושיטות.התגובה המכילה nsp5-His6 (מסלול 1) ו-nsp9-His6 (נתיב 2) שימשה כביקורת.לאחר 10 דקות, התגובה הופסקה ותערובת התגובה הופרדה על ידי SDS-PAGE.החלבון נצבע ב-Coomassie Brilliant Blue (A, למעלה).מבשר Nsp7-11-His6 והמוצר המעובד הנובע ממחשוף בתיווך nsp5-His6 מוצגים בצד ימין.שימו לב (בשל גודלם הקטן) כי nsp7 ו-nsp11-His6 אינם ניתנים לזיהוי בג'ל זה, והתגובה מתווספת עם nsp5-His6 (נתיבים 1 ו-4; המיקום של nsp5-His6 מסומן באמצעות עיגול מלא) או nsp9-His6 (מסלול 2) מכיל כמות קטנה של MBP (מסומן על ידי עיגולים פתוחים) בתור זיהומים שיוריים מכיוון שהם מתבטאים כחלבוני היתוך MBP (נספח SI, טבלה S1).(ב) הווריאציה של Nsp9-His6 חסרה שארית Asn אחת או שתיים N-טרמינליות (מספור שאריות לפי המיקום ב-pp1a/pp1ab) והיא מטוהרת ומודגרת עם nsp12-His6 ו-[α-32P] UTP.B, SDS-PAGE מוכתם ב-Coomassie מוצג בחלק העליון, B, האוטורדיוגרף המתאים מוצג בתחתית.המיקום של סמן המשקל המולקולרי (בקילודלטון) מוצג בצד שמאל.(ג) שיירים משומרים של HCoV-229E nsp9-His6 N-terminal הוחלפו ב-Ala או Ser, ואותה כמות חלבון שימשה בתגובת UMPylation בתיווך nsp12-His6.תוצרי התגובה הופרדו על ידי SDS-PAGE ונצבעו ב-Coomassie Brilliant Blue (C, למעלה), ו-nsp9-His6 מסומן רדיואקטיבי זוהה באמצעות הדמיית זרחן (C, באמצע).באמצעות חלבון מסוג פראי (wt) כהתייחסות (מוגדר ל-100%), פעילות ה-NMPylation היחסית (ממוצע ± SEM) חושבה משלושה ניסויים בלתי תלויים.(ד) טיטרי וירוסים בסופרנטנט של תרבית תאי p1 של תאי Huh-7 הנגועים בתאי Huh-7 פרא מסוג HCoV-229E, ומוטנטים הנושאים תחליפי חומצות אמינו ייעודיים ב-nsp9 נקבעו על ידי בדיקת פלאק.המוטיב C הכפול DD4823/4AA מוטיב RdRp חסר שכפול שימש כביקורת שלילית.
קצה ה-N של nsp9 (במיוחד עמדות 1, 2, 3 ו-6) שמור מאוד בקרב בני תת-משפחת ה-Orthocoronavirinae (נספח SI, איור S6).על מנת לחקור את התפקיד האפשרי של שיירים אלה ב-nsp12-בתיווך nsp9 NMPylation, שני שיירי Asn עוקבים בקצה N-terminus של nsp9 הוחלפו ב-Ala או Ser (לבד או בשילוב).בהשוואה ל-nsp9 מסוג פרא, החלפת N3825 ב-Ala או בסר הביאה ליותר מפי שניים ב-UMPylation בתיווך nsp12 (איור 5C).בהתאם למסקנה שלנו כי NMPylation מתרחשת באמין הראשוני N-טרמינלי במקום בשרשרת הצדדית של שארית N-טרמינלית, ראינו NMPylation שיורי משמעותי עם החלפת N3825A ו-N3825S.מעניין שאם ה-Asn השני מוחלף ב-Ala או ב-Ser, UMPylation של nsp9 מופחת חזק יותר (יותר מפי 10), בעוד שהחלפה של Ala בעמדות 3, 4 ו-6 משפיעה רק על nsp9 UMPylation (איור 2). ).5C).תוצאות דומות התקבלו באמצעות ATP, CTP או GTP (נספח SI, איור S8).ביחד, נתונים אלה מצביעים על תפקיד המפתח של N2826 (מיקום 2 ב-nsp9) ב-nsp9 NMPylation.
על מנת להשיג ראיות נוספות למתאם הפונקציונלי בין ה-N-terminus של nsp9 ו-NMPylation, ביצענו יישור רצף מרובה (MSA) של רצף nsp9 של משפחת הקורונה (המשתנה בין 104 ל-113 שיירים) (נספח SI, איור S6).בסך הכל, ב-47 מינים (ידועים ומשוערים) של 5 סוגים מתת-משפחת Orthocoronavirinae שמדביקים יונקים, ציפורים ומארחים שונים של זוחלים, רק 8 שאריות בסך הכל נמצאו בלתי משתנים.השינויים הנרחבים ביותר, כולל מחיקות והחדרות, נצפו במחזורים בין מרכיבי המבנה המשני של nsp9, כפי שנקבע על ידי מחקרים מבניים קודמים (26 ??28).נמצאו חמישה שיירים בלתי משתנים בגדיל β ובסליל α של החלק C-טרמינלי של nsp9.שלושה שיירים בלתי משתנים מהווים את מוטיב ה-NNE של קצה ה-N של nsp9.מתגלה כי ה-Asn השני של מוטיב זה הוא השריד הבלתי משתנה היחיד, אשר משותף גם ל-nsp9 ההיפותטי של נגיף הקורונה הצפרדע הקשור רחוק, ומייצג את המין Microhyla letovirus 1 בתת-משפחת Letovirinae של Alphaletovirus.ניתן לתרץ את שימור השאריות באלמנטים של מבנה משני של nsp9 על ידי שיקולים מבניים כדי לשמור על קיפול או תכונות קושרות ידועות ל-RNA.עם זאת, נראה שהנימוק הזה אינו חל על שימור ה-NNE, ולפני מחקר זה, טבעם של האילוצים המגבילים את השונות של רצף הטריפפטיד היה מעורפל לחלוטין.
על מנת לקבוע את החשיבות של nsp9-NMPylation ושימור NNE בשכפול נגיף הקורונה, הפקנו מוטציות HCoV-229E, הנושאות החלפות בודדות או כפולות של שאריות nsp9 N-terminal, מה שמצביע על כך ש-nsp9 NMPylation מזיק במבחנה.לפני שנתחיל, אנו מנסים לענות על השאלה האם ההחלפות הללו (ליד אתר המחשוף nsp8|9) משפיעות על העיבוד הפרוטאוליטי של אזור ה-C-terminal pp1a.קבוצה של מבני nsp7-11 פוליפרוטאינים המכילים החלפות תואמות בקצה ה-N של nsp9 הופקו ב-E. coli ונחתכו עם Mpro רקומביננטי.הביקוע הפרוטאוליטי של ארבעת האתרים (כולל האתר האגף nsp9) אינו מושפע באופן משמעותי על ידי תחליפים כלשהם שהוכנסו (נספח SI, איור S9), למעט שינויים מבניים בחלבונים אלה המפריעים לביקוע nsp8|9 בתיווך Mpro (או אחר) אתר אינטרנט.
תאי Huh-7 הועברו טרנספקט עם RNA HCoV-229E באורך גנום, המקודדים להחלפות Ala או Ser בטריפפטידים NNE המשמרים (N3825, N3826 ו-E3827) בקצה nsp9 N, מה שמראה שרוב המוטציות הן קטלניות.הצלחנו להציל את הנגיף על ידי החלפת ה-Ser או Ala של ה-N-terminal Asn (N2835A או N2835S), אך לא הצלחנו לשחזר את הנגיף עם מוטציות בודדות וכפולות אחרות ברצף NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS) , E3827A) (איור 5D).
תוצאות אלו מצביעות על כך שהשכפול של נגיף קורונה בתרבית רקמה מוגבל (זהה או דומה), מגביל את המוטציה הטבעית של אתרי NMPylation nsp9 בגוף, ותומכים בתפקיד המפתח של תגובה זו במחזור החיים של נגיפים.
בקבוצת הניסויים האחרונה, הפקנו His6 מסוף C המסומן SARS-CoV-2 nsp12 ו-nsp9, ושתי צורות מוטנטיות של nsp12 ב-E. coli.שיירי האתר הפעילים בתחומי NiRAN ו-RdRp היו בהתאמה השתמש ב-Ala במקום זאת (איור 6A ו-SI נספח, טבלה S2).K4465 ב-SARS-CoV-2 nsp12 תואם ל-K4135 ב-HCoV-229E (נספח SI, איור S2), אשר הוכח כנדרש עבור פעילות NiRAN ושכפול HCoV-229E (איור 3D ו-E).שארית זו תואמת גם לשארית הנגיף העורקי EAV nsp9 K94, אשר הוכח בעבר ככרחית עבור NiRAN self-UMPylation/self-GMPylation (16).כפי שמוצג באיור 6B, ל-SARS-CoV-2 nsp12 יש פעילות טרנספראז של UMP באמצעות nsp9 כמצע, בעוד שמוטנט האתר הפעיל nsp12_K4465A אינו פעיל.ההחלפה הכפולה ברצף המאפיין SDD של מוטיב RdRp C אינה משפיעה על פעילות UMP transferase (איור 6B), מה שמעיד על כך שלפעילות RdRp אין השפעה ישירה ב-nsp9 UMPylation.נתונים דומים התקבלו באמצעות CTP, GTP ו-ATP (נספח SI, איור S10).לסיכום, נתונים אלו מצביעים על כך של-NMPylation nsp9 בתיווך NiRAN יש פעילות שמרנית בנגיפים המייצגים סוגים שונים של תת-משפחת האורתוקורונה.
SARS-CoV-2 nsp12 בתיווך NMPylation של nsp9.(א) ג'ל SDS-polyacrylamide מוכתם Coomassie המראה את החלבון הרקומביננטי המשמש בבדיקת NMPylation.כבקרה, נעשה שימוש בחלבון מוטנטי עם החלפת אתר פעיל בתחום NiRAN (K4465A) ו-RdRp (DD5152/3AA) של SARS-CoV-2 nsp12.מספור השאריות מבוסס על מיקום ב-pp1ab.(ב) אוטורדיוגרף של זיהוי UMPylation באמצעות nsp9-His6 ו-[α-32P]UTP כמצע של nsp12-His6 (סוג פראי [wt] ומוטנט).המסה המולקולרית (בקילודלטון) של החלבון המסומן מוצגת בצד שמאל.
דומיינים של NiRAN נשמרים בדרך כלל ב-Nidovirales (16), מה שמצביע על כך שהם מזרזים תגובות אנזימטיות החיוניות לשכפול של Nidovirus.במחקר זה, הצלחנו להוכיח שתחום NiRAN של נגיף הקורונה מעביר את NMP (נוצר מ-NTP) ל-nsp9, חלבון קושר RNA מסתורי המעורב בשכפול הנגיף (26 ?? 29), כדי לקבוע אותו כמטרה טבעית. שותף של נגיף הקורונה RTC.
תחום NiRAN חולק שלושה מוטיבים ברצף (AN, BN ו-CN), המכילים מספר קטן מאוד של שיירים שנשמרים בכל המשפחות בסדר ה-Nidovirales המונופילטי אך המובחן ביותר (8, 16).מחקרים אחרונים הראו שהם קשורים מבחינה מבנית למשפחה לא מאופיינת ברובה של חלבונים דמויי חלבון קינאז, אשר נקראו במקור משפחת SelO (17, 19, 22, 30, 31).לחלבונים הקשורים ל-SelO יש קפלי קינאז, אך חסרים כמה שיירי אתר פעילים שמורים בקינאזות קלאסיות (22, 32).בהתבסס על האוריינטציה ההפוכה של מולקולות ATP הקשורות לאתר הפעיל ויוצבו על ידי אינטראקציות ספציפיות, עלתה השערה של SelO ואושרה לאחר מכן להעביר AMP (במקום פוספט) למצע החלבון (22), בעוד שחלבון חיידקי דמוי SelO YdiU יש לאחרונה הוכח כמזרז את ההתקשרות הקוולנטית של UMP ל-Tyr ולשאריות שלו של מצעי חלבון שונים (33).
על מנת לאשר ולהרחיב את החיזוי של שיירי האתר הפעילים המשוערים של תחום הקורונה NiRAN, השתמשנו בשיטות ביוכימיות ובשיטות גנטיקה הפוכה כדי לבצע ניתוח מוטציות בנגיף הקורונה nsp12 (איור 3D ו-E ו-SI נספח, איור S3 וטבלה) S1â S4).הנתונים מראים כי ההחלפה של HCoV-229E K4135, R4178 ו-D4280 ב-Ala מבטלת את פעילות ה-NMP טרנספראז במבחנה ואת שכפול הנגיפים בתרבית תאים (איור 3D ו-E ו-SI נספחים, איור S3), התומכים בנוכחותם ב-NTP γ-פוספט (K4135, R4178) והתיאום של יוני מתכת פעילים באתר (D4280).החלפת ה-E4145A של Glu שמור בטווח של נגיף קן הציפור שצפוי לייצב את עמדת K4135 (17) הוכחה כמבטלת שכפול ויראלי, אך באופן מפתיע, הפעילות נשמרה במבחן NMPylation in vitro (איור 3D ו-E ו נספח SI, איור S3 וטבלאות S1-S4).תצפית דומה נעשתה כאשר התחלופה המקבילה הוכנסה בהומלוג YdiU של Salmonella typhimurium (E130A) (33).יחד, נתונים אלה תומכים בפונקציה הרגולטורית של שארית נשמרת זו ולא בתפקוד הקטליטי.
החלפת שאריות ה-Phe השמורות (F4281A) בטווח של nestovirus בתחום HCoV-229E NiRAN (8) הביאה לירידה בפעילות ה-NMPylation in vitro ולירידה משמעותית בשכפול הנגיף בתרבית תאים (איור 3D, E ו-SI) נספח, איור S3).הנתונים תואמים את הפונקציה הרגולטורית החשובה של שארית זו, כמו שאריות Phe המוטיב הומולוגי של DFG שהוצגו בעבר.בקינאזות חלבון קלאסיות, הוא חלק מלולאת הקישור של Mg2+ ועוזר להרכיב ולווסת את עמוד השדרה???נדרש לפעילות קטליטית יעילה (32, 34).החלפת שאריות K4116 של Ala ו-Arg (במוטיב ה-preAN), בהתאמה, ביטלה שכפול ויראלי וכצפוי, היו לה השפעות שונות על פעילות NMP טרנספראז במבחנה, בהתאם לשרשרת הצדדית של חומצות האמינו שהוצגה (איור 3D ו-E ו-SI). , איור S3).הנתונים התפקודיים תואמים את המידע המבני, מה שמצביע על כך ששאריות זה יצר אינטראקציה עם פוספט ATP (17).בתחום NiRAN של משפחות וירוסים מקוננות אחרות, המיקום של HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 תפוס על ידי Lys, Arg או His (8), מה שמעיד על כך שההגבלה התפקודית של שארית ספציפית זו נרגעה.ההחלפה של D4188A ו-D4283A מבטלת או מפחיתה מאוד את פעילות האנזים ומבטלת את שכפול הנגיפים (איור 3).שני השרידים הללו נשמרים ברוב (אך לא כולם) הנגיפים המקוננים (8), מה שמצביע על פונקציה חשובה ספציפית למשפחה אך אולי לא קטליטית.החלפות Ala של כמה שיירי Lys ו- Asp אחרים (K4113A, D4180A, D4197A ו-D4273A) שאינם נשמרים במשפחות Coronaviridae או Nestioviridae אחרות (8) שימשו כביקורות.כצפוי, תחליפים אלה נסבלים במידה רבה, עם ירידה קלה בפעילות האנזים ובשכפול ויראלי במקרים מסוימים (איור 3 וספח SI, איור S3).בסך הכל, נתוני המוטגנזה של נגיף הקורונה תואמים מאוד לנתוני ה-GMP העצמי והגנטיקה ההפוכה של EAV NiRAN-RdRp (16), בהם שייר EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) K94 (המקביל ל-HCoV-229E K4135) מתפקד חשוב), R124 (מקביל ל-R4178), D132 (מקביל ל-D4188), D165 (מתאים ל-D4280), F166 (מקביל ל-F4281).בנוסף, נתוני המוטגנזה של HCoV-229E תואמים ומורחבים מנתוני הגנטיקה ההפוכה של SARS-CoV שדווחו בעבר (16), בדיוק באותה מידה שדומים מאוד לאלו שנצפו עבור מוטיב ה-CN המקביל Phe-to-Ala המוטנטי SARS-CoV_nsp12. הפנוטיפ המתואר -F219A ו-HCoV-229E_F4281A (איור 3 D ו-E ו-SI נספח, איור S3 וטבלה S1-S4).
בהשוואה לאורתולוגים EAV (16), שיש להם העדפה ברורה ל-UTP ו-GTP (בתגובת ה-NMPylation העצמית), המחקר שלנו מראה שתחום הקורונה NiRAN (מיוצג על ידי HCoV-229E ו-SARS-CoV-2) יכול להיות יעיל העביר את כל ארבעת ה-NMP, אם כי יש העדפה קלה ל-UMP (איורים 1 ו-3).הספציפיות הנמוכה יחסית של מצע המשותף NTP הספציפי תואמת את המבנה הסופר-מרוכב SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 שדווח לאחרונה, שבו ADP-Mg2+ נקשר לאתר הפעיל של NiRAN, אך לא עם חלק אדנין. של היווצרות אינטראקציות ספציפיות (17).במחקר שלנו, לסוג הנוקלאוטיד המשמש בתגובת ה-NMPylation אין השפעה דיפרנציאלית על פעילות החלבון המוטנטי (נספח SI, איור S3), מה שמעיד על כך שאף אחד מהשאריות הללו אינו קשור קשר הדוק לקישור של נוקלאובסיס ספציפי.יש לחקור את הבסיס המבני והמשמעות הביולוגית הפוטנציאלית של העדפות שיתוף-מצע NTP השונות שנצפו בתחומי NiRAN של וירוסים וירוסים עורקים;הם עשויים להיות נכונים או עשויים להיות בגלל המגבלות של הלימודים שלהם.נכון להיום, לא ניתן לשלול שלפעילות ה-NMPylator הפוטנציאלית של תחום הנגיף העורקי NiRAN (בהשוואה לפעילות העצמית של NMPylation שאפיינה בעבר) יש העדפה שונה של מצע משותף, בהתחשב בכך שהדמיון בין העורק לנגיף הקורונה דומיין NiRAN נמצא בגבולו.השווה מבוסס רצף (16).בהשוואה ל-pseudokinase SelO, המשתמש ב-Mg2+ כקו-פקטור, הפעילות של נגיף הקורונה והנגיף העורקי NiRAN תלויה ב-Mn2+ (16) (איור 3C ו-SI נספח, איור S1).התלות ב-Mn2+ וההעדפה הברורה ל-UTP היא תכונה יוצאת דופן של NMPylators של חלבון, ורק לאחרונה אושרה בחלבון YdiU של Salmonella typhimurium, אשר מזרז את UMPylation של מלווה חלבון קפדני תלוי Mn2+ כדי להגן על תאים מפני מאגר ATP של תאים גרידת מתח ( 33).
הדמיון המבני שתואר לאחרונה בין תחום הקורונה NiRAN לבין קינאזות חלבון תאי (17, 19) מספק תמיכה נוספת ליכולת של NiRAN לקשר NMP קוולנטית לחלבונים אחרים שעליהם דיווחנו במחקר זה.מיקדנו את החיפוש שלנו אחר יעדי NiRAN אפשריים בחלבונים המקודדים על ידי HCoV-229E ORF1a, אשר ידועים כמסייעים באופן ישיר או עקיף לשכפול המקודד ORF1b של RTC (12, 35).הניסויים שלנו מספקים ראיות חותכות ל-NMPylation יעיל וספציפי של nsp9 (איור 2).אם משתמשים בחלבון המטרה בעודף טוחני הגבוה פי 8 עד 10 מזה של האנזים (nsp12), יאושר ש-nsp9 הוא לחלוטין (מונו) NMPized (איור 4).הגענו למסקנה שהאינטראקציה בין nsp12 ל-nsp9 היא קצרת מועד ולא תיצור קומפלקס יציב עם nsp9 (בהיעדר תת-יחידות RTC אחרות).מסקנה זו נתמכת על ידי מחקרי אינטראקציה של חלבון על פרוטום SARS-CoV (35).ניתוח טרשת נפוצה זיהה את האמין העיקרי של שארית ה-N-טרמינלית של nsp9 כאתר NMPylation (נספח SI, איור S5).היווצרות הקשר הפוספורמידאט וקבוצת האמינו ה-N-טרמינלית מבדילה את פעילות ה-NMPylation בתיווך NiRAN מתגובת ה-AMPylation המתווכת Pseudomonas syringae SelO, המזרזת את היווצרות AMP מקושר O ב-Ser, Thr, או שאריות פפטיד של Tyr ( 22), ו-S. typhimurium YdiU יוצר תוספות O-linked (עם Tyr) ו-N-linked (עם His) פפטיד-UMP.המידע המוגבל הזמין על משפחת החלבונים SelO מצביע על כך שבני משפחת חלבונים גדולה זו נבדלים מאוד ביצירת תוספות פפטיד-NMP.זוהי תצפית מעניינת שראויה למחקר נוסף.
הנתונים שהתקבלו במחקר זה הובילו אותנו להשערה שה-NMPylation של nsp9 דורש קצה N חופשי.בהקשר של שכפול ויראלי, זה יסופק על ידי ביקוע פרוטאוליטי של אתר העיבוד nsp8|nsp9 בפוליפרוטאין העתק pp1a המתווך על ידי Mpro ו-pp1ab.ברוב נגיף הקורונה, ההבדל בין האתר הספציפי הזה (VKLQ|NNEI ב-HCoV-229E) לבין כל שאר אתרי המחשוף של נגיף הקורונה Mpro הוא Asn (ולא עוד שאריות קטנות, כגון Ala, Ser Or Gly) תופסות P1â???מיקום (36).נתוני ביקוע הפפטידים שהתקבלו במחקרים המוקדמים הראו שיעילות הביקוע של אתר nsp8|nsp9 הייתה נמוכה מזו של אתרים אחרים, מה שמצביע על כך ש-1) לאתר ספציפי זה עשוי להיות תפקיד רגולטורי בעיבוד המתואם בזמן של ה-C-טרמינל. אזור pp1a, או 2) a תפקידו של ה-N-terminus המיוחד השמור של nsp9 בשכפול הנגיף (37).הנתונים שלנו (איור 5A) הראו שהצורה הרקומביננטית של nsp9 הנושאת את רצף ה-N-טרמינלי האמיתי עברה NMP ביעילות על ידי nsp12.הרצף האגף N-טרמינלי הוסר על ידי פקטור Xa (nsp9-His6; נספח SI, טבלה S1) או מחשוף בתיווך Mpro (nsp7-11-His6; איור 5A וספח SI, טבלה S1).חשוב לציין, המבשר הלא חתוך המכיל nsp9 nsp7-11-His6 הראה עמידות ל-NMPylation של nsp12, דבר העולה בקנה אחד עם הנתונים שלנו, מה שמצביע על כך שהתוספת nsp9-NMP נוצרת דרך האמין הראשוני N-termine (נספח SI, איור S5) .כדי לקבל הבנה מעמיקה יותר של סגוליות המצע של NiRAN, התמקדנו בשאריות ה-N-טרמינליות הסמוכים של nsp9.בהיעדר חלבונים אחרים, הם גמישים מבחינה מבנית, ומונעים מהם להתגלות בצורה הלא מסומנת של nsp9 (26 28, 38), מה שמצביע על השונות הטבעית המוגבלת שלהם. פונקציה של מקטע nsp9 N-terminal.החלפות Ala של שיירים שמורים באזור זה (איורים 5C ו-D וספח SI, איור S8) מגלים ש-N3826 חיוני ל-nsp9 NMPylation in vitro, בעוד שתחליפים N3825A ו-E3827A מובילים לירידה ב-NMPylation, בעוד שתחליפים של M3829A ו-P3830A .ברור להשפיע על NMPylation של nsp9.למרות שההחלפה של N-terminal Asn (N3825A, N3825S) משפיעה רק על nsp9 NMPylation ושכפול נגיפים בתרבית תאים (איור 5C ו-D), המחיקה של רצף שאריות Asn מהדיפפטיד N-terminal 3825-NN הוכח כי הוא קטלני לווירוסים, מה שמצביע על כך שנדרש שארית Asn אחת לפני שארית אחרת בקצה N, רצוי Asn, אם כי נראה שניתן לסבול חלקית החלפה של שאריות דומות (איור 5B, C ו-D).אנו מסיקים שהדיפפטיד 3825-NN, במיוחד שייר N3826 המשומר והחיוני בטווח נגיף הקורונה (נספח SI, איור S6), מבטיח את הקישור והכיוון הנכונים של ה-nsp9 N-terminus באתר הפעיל של NiRAN.
החלפה של Ala (E3827A) ב-Glu השמור מכל תת-המשפחות שומרת על NMPylation של nsp9 במבחנה, אך היא קטלנית לנגיפים בתרבית תאים (איור 5C ו-D), מה שמצביע על התפקוד הנוסף של שארית זו, למשל, באינטראקציות מפתח (NMPylated או ללא שינוי ) nsp9 N-terminus וגורמים אחרים המעורבים בשכפול הנגיף.מוטציות Nsp9 לא השפיעו על התהליך הפרוטאוליטי של nsp9 או כל nsps סמוך (39) (נספח SI, איור S9), מה שמצביע על כך שהפנוטיפים הקטלניים של כמה מוטציות nsp9 שנצפו לא נגרמו על ידי חוסר ויסות של אזור C פרוטאוליטי-טרמינלי של תהליך C. .
הנתונים שלעיל מספקים הוכחה לכך שאחרי טיפול בתיווך Mpro באתר המחשוף nsp8|9 ב-pp1a/pp1ab, ניתן לבצע UMPylated (או לשנות חלקית עם NMP אחר) את ה-N-terminus של nsp9.בנוסף, השימור המצוין של ה-N-terminus של nsp9 (כולל שיירי Asn הבודדים והבלתי משתנים במשפחת הקורונה) ונתוני הגנטיקה ההפוכה שהתקבלו במחקר זה (איורים 3E ו- 5D) הביאו אותנו למסקנה שה-NMPylation של nsp9 המתואר קשור ביולוגית וחיוני לשכפול נגיף הקורונה.יש לחקור את ההשלכות התפקודיות של שינוי זה, למשל, לגבי פעילות קושרת ה-RNA שתוארה קודם לכן (הלא ספציפית) nsp9 (צורה לא שונה) (2628).NMPylation N-terminal עשויה להשפיע גם על האינטראקציה של nsp9 עם מצעי חלבון או RNA או על היווצרות של מכלולים שונים בארבע רמות.אלה נצפו במחקרים מבניים ואושרו כקשורים תפקודיים לשכפול נגיף הקורונה, אם כי במיוחד בהיעדר במקרה של שינוי זה (26- â29, 40).
למרות שסגוליות היעד של תחום הקורונה NiRAN עדיין צריכה להיות מאופיינת ביתר פירוט, הנתונים שלנו מראים שסגוליות יעד החלבון של תחום הקורונה NiRAN צרה מאוד.למרות שהשימור של שיירי מפתח פעילים (8, 16) בתחום ה-Niran של כל משפחות הנידו-וירוס תומך מאוד בפעילות של החלבונים ה-NMPylator השמור, זהות שרידי הכיס קושר המצע של תחום זה נותר לאפיין שימור ושימור , ועשויים להיות שונים בין משפחות שונות של מטרות Nidovirales.באופן דומה, המטרות הרלוונטיות של וירוסים מקוננים אחרים טרם נקבעו.הם עשויים להיות אורתולוגים מרוחקים של nsp9 או חלבונים אחרים, מכיוון שהרצפים מחוץ לחמשת תחומי העתק שנשמרים בדרך כלל בנגיפים מקוננים פחות משומרים (8), כולל מערך הגנום בין Mpro ל-Niran, ביניהם, nsp9 ממוקם ב- נגיף הקורונה.
בנוסף, איננו יכולים כרגע לשלול את האפשרות שלדומיין NiRAN יש מטרות נוספות (כולל סלולריות).במקרה זה, ראוי להזכיר שלהומולוגים החיידקיים בחלבון המתהווה NMPylators (NMPylators) (30, 31) נראה שיש "רגולטורים ראשיים"?NMP מווסת מגוון של חלבונים תאיים כדי לווסת או לחסל את פעילויותיהם במורד הזרם, ובכך משחק תפקיד במגוון תהליכים ביולוגיים, כגון תגובת מתח תאית והומיאוסטזיס חיזור (22, 33).
במחקר זה (איורים 2 ו-4 וספח SI, איורים S3 ו-S5), הצלחנו להוכיח ש-nsp12 העביר את החלק UMP (NMP) למיקום יחיד (שמור) ב-nsp9, בעוד שחלבונים אחרים לא שונו ב- בשימוש בתנאים, ספציפיות מצע מוגדרת היטב (ולא רופפת) נתמכת.בהתאם לכך, בהשוואה ל-N-טרמינלי nsp9 NMPylation, פעילות ה-NMPylation של nsp12 עצמה נמוכה מאוד, הזיהוי שלו דורש זמן חשיפה אוטורדיוגרפי ארוך יותר, ונעשה שימוש בעלייה של פי 10 בריכוז nsp12.בנוסף, ניתוח הטרשת הנפוצה שלנו לא הצליח לספק ראיות ל-NMPylation של nsp12, מה שמצביע על כך ש-NMPylation עצמי של תחום NiRAN היא (במקרה הטוב) פעילות משנית.עם זאת, יש לציין כי מחקרים אחרים סיפקו ראיות ראשוניות לכך שמצב ה-AMPylation העצמי של NMPylator חיידקי עשוי לשלוט בפעילות ה-NMPylation שלהם על מצעי חלבון אחרים (22, 33).לכן, יש צורך במחקר נוסף כדי לחקור את ההשפעות הפונקציונליות האפשריות של פעילויות NMPylation עצמית שדווחו עבור EAV nsp9 (16) ו-coronavirus nsp12 (מחקר זה), כולל ההשפעה המוצעת דמוית מלווה על קיפול תחום ה-C-terminal RdRp ( 16) ).
בעבר, נבחנו מספר השערות לגבי הפונקציות האפשריות במורד הזרם של תחום NiRAN Nidoviral, כולל RNA ligase, RNA-capped guanylate transferase ופעילות תחול החלבון (16), אך אף אחת מהן אינה תואמת את הפונקציות הזמינות במורד הזרם.המידע המתקבל בעמדות הבאות הוא בדיוק אותו הזמן ללא הנחות נוספות.הנתונים שהתקבלו במחקר זה תואמים ביותר (אך אינם יכולים להוכיח) שתחום NiRAN מעורב בהתחלת סינתזת RNA המושרה על ידי חלבון.בעבר האמינו כי הפונקציה של תחום NiRAN ב-5??מכסת ²-RNA או תגובות קשירת RNA אינן מושפעות מאלה ומתמיכה בנתונים אחרים.לפיכך, למשל, האתר הפעיל של NiRAN נחשב לכרוך ב-Asp השמור כבסיס כללי (D252 ב-Pseudomonas syringae SelO; D4271 ב-HCoV-229E pp1ab; D208 ב-SARS-CoV-2 nsp12) (נספח SI, איור 2) ).S2) (17, 22, 33), בעוד שהקטליזה בליזת ה-RNA תלויה ב-ATP ובאנזים מכסת ה-RNA מתבצעת על ידי האנזים הקוולנטי-(lysyl-N)-NMP ביניים, הכולל שייר ללא Changed Lys ( 41).בנוסף, הספציפיות המדהימה המבוססת על רצף של נגיף הקורונה NiRAN למטרות חלבון משומר והספציפיות הרגועה עבור מצעים משותפים של NTP (מעדיף UTP) מתנגדת לתפקודים דמויי ליגאז של RNA בתיווך NiRAN.
ברור, נדרשת עבודה נוספת כדי לאמת, ואם יוכח, לפרט את התפקיד האפשרי של nsp9-UMP (nsp9-NMP) בסינתזת RNA המושרה על ידי חלבון, מה שיחבר בין כמה דיווחים מעניינים אך (עד כה) שדווחו בעבר. .תצפיות בודדות.לדוגמה, נקבע שסוף ה-RNA שלילי הגדיל של נגיף הקורונה מתחיל בגדיל אוליגו(U) (42, 43).תצפית זו עולה בקנה אחד עם הרעיון שהסינתזה של RNA גדיל שלילי מתחילה על ידי קשירת הצורה UMPylated של nsp9 לזנב ה-poly(A) (טריגרים), אשר עשוי להתקדם על ידי קשירת ה-RNA שלו. הפעילות ו/או האינטראקציה עם חלבון RTC אחר.לאחר מכן ניתן להשתמש בחלק ה-UMP המסופק על ידי nsp9 כ"פריימר" לאוליגורידילציה בתיווך nsp7/8/nsp12, תוך שימוש בזנב 3??²-poly(A) ב-RNA הגנומי או ברצף המכיל אוליגו (A) אחר. משמש כתבנית, בדומה למנגנון שנקבע לחלבון VPg של picornavirus (44).מה אם ההצעה "לא נורמטיבית"????התחלת סינתזת ה-RNA של הגדיל השלילי (הנגרמת על ידי חלבון) מספקת קישור לתצפיות, מה שמצביע על כך של-RNA שלילי הקורונה יש UMP (במקום UTP) בקצהו (42), מה שנחשב כמצביע על כך חומצת הגרעין Dicer מבקעת את הקצה הפוספוריל על ידי אנדונוקלאז לא ידוע לאורידין.אם תאושר, פעילות הידרוליטית זו של חומצת גרעין יכולה לעזור לשחרר את הצורה האוליגומרית UMPylated של nsp9 מקצה 5 ² של הגדיל השלילי המתהווה.התפקיד האפשרי של nsp9 ב-priming חלבון עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים של גנטיקה הפוכה, שהראו ש-nsp9 (ו-nsp8) מתקשרים באופן קריטי וספציפי עם אלמנט ה-RNA הפועל ב-cis השמור ליד הקצה השלישי של גנום הקורונה.45).על פי דוח זה, כעת ניתן לבחון מחדש את התצפיות הקודמות הללו ולהרחיב אותן באמצעות מחקר נוסף.
לסיכום, הנתונים שלנו קבעו את הפעילות הספציפית של תג אנזים נגיף קנייני מקושר ל-RdRp בקצה ה-N.בנגיף הקורונה, פעילות UMPylator/NMPylator שהתגלתה לאחרונה באמצעות NiRAN משמשת להסתמך על Mn2+ ושאריות Asn סמוכים ולגרום להיווצרות קשרים פוספורמידאטים (בעלי אנרגיה נמוכה) עם האמין הראשוני N-terminal.באמצעות ביקוע בתיווך Mpro באתר הביקוע nsp8|9, ניתן להשתמש במטרת nsp9 ל-NMPylation, מה שמצביע על הצימוד הפונקציונלי בין הפרוטאז לתחום NiRAN, המשתרע עד ל-RdRp.השימור של שאריות מפתח באתר הפעיל nsp12 NiRAN וביעד nsp9, בשילוב עם נתונים שהתקבלו משני נגיפים כולל SARS-CoV-2, מספקים ראיות חזקות לכך ש-nsp9 NMPylation הוא נגיף קורונה תכונות שמרניות הן גם שלב מרכזי בשכפול הנגיף.הנתונים הזמינים מובילים אותנו למסקנה שהתפקיד הספציפי של צורת NMPylated של nsp9 בסינתזת RNA המושרה על ידי חלבון הוא תרחיש סביר עבור וירוסים וירוסים מקוננים אחרים, וניRAN עשויה למקד גם לחלבונים לא מזוהים אחרים.לווסת את הנגיף.אינטראקציה מארח.אם תאושר, מעורבותם של פריימרים חלבונים בסינתזת RNA ויראלי תגביר את זיקת הרצף של תחומי ה-Mpro/3CLpro ו-RdRp בין נגיף הקורונה שזוהה בעבר וקבוצת העל דמוית picornavirus (9), אשר אוחדו כעת ב-Pisonivirites שהוקמה לאחרונה ( 46) בקטגוריה.
הנתונים שלנו מראים גם שפעילויות האנזים הבסיסיות, הסלקטיביות והשמרניות שזוהו במחקר זה יכולות לשמש כמטרות לתרופות אנטי-ויראליות.ניתן לפתח תרכובות המפריעות לקשירה (ולשינוי לאחר מכן) של קצה ה-nsp9 השמור באתר הפעיל של NiRAN לתרופות אנטי-ויראליות יעילות ורסטיליות, המתאימות לטיפול בנגיף קורונה של בעלי חיים ובני אדם מזיהומים שונים (תת-סוגים) , כולל SARS-CoV-2 ותסמונת הנשימה במזרח התיכון וירוס קורונה.
רצף הקידוד של חלבון הקורונה שנוצר במחקר זה הוגבר על ידי RT-PCR באמצעות RNA שבודד מ-Huh-7 נגוע ב-HCoV-229E או Vero E6 הנגוע ב-SARS-CoV-2, והוחדר באמצעות נהלי שיבוט סטנדרטיים.pMAL-c2 (מעבדה ביולוגית של ניו אינגלנד) או pASK3-Ub-CHis6 (47) וקטור ביטוי (נספח SI, טבלאות S1 ו-S2).החלפות קודון בודדות הוכנסו על ידי מוטגנזה מכוונת-אתר מבוססת PCR (48).כדי לייצר את חלבון ההיתוך MBP, תאי E. coli TB1 הועברו טרנספורמציה עם מבנה הפלסמיד המתאים pMAL-c2 (נספח SI, טבלה S1).חלבון ההיתוך טוהר על ידי כרומטוגרפיה של זיקה לעמילוז ופוצל עם פקטור Xa.לאחר מכן, החלבון המתויג ב-C-Terminal His6 טוהר על ידי כרומטוגרפיה של זיקה מתכת מגובבת ל-Ni (Ni-IMAC) כפי שתואר קודם לכן (49).כדי לייצר את חלבון היתוך Ubiquitin, תאי E. coli TB1 השתמשו במבנה הפלסמיד המתאים pASK3-Ub-CHis6 (נספח SI, טבלאות S1 ו-S2) וב-pCGI פלסמיד DNA המקודד לאוביקווטין הידרולאז C-טרמינלי ספציפי 1 (Ubp1).טרנספורמציה (47).חלבון הקורונה המתויג ב-C-טרמינל His6 טוהר כפי שתואר קודם (50).
בדיקת NMPylation עצמית של HCoV-229E nsp12-His6 בוצעה כמתואר ב-EAV nsp9 (16).בקיצור, nsp12-His6 (0.5 µM) מכיל 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)-KOH, pH 8.0, 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM incubate incubate ה-NTP שצוין ו-0.17 µM התאימו ל-[α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) ב-30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.בכל מבחני NMPylation האחרים (סטנדרטיים) של nsp12 בתיווך nsp9 NMPylation, תנאי התגובה מותאמים באופן הבא: nsp12-His6 (0.05 µM) ו-nsp9-His6 (4 µM) בנוכחות 50 mM HEPES-KOH (pH 8). ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM ציינו NTP ו-0.17 µM תואמים [α32-P]NTP.לאחר דגירה של 10 דקות ב-30 מעלות צלזיוס, דגימת התגובה עורבבה עם חיץ מדגם SDS-PAGE: 62.5 מ"מ tris(hydroxymethyl)aminomethane HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2.5% SDS, 10% גליצרול ו-0.005% bromophenol כְּחוֹל.החלבון עבר דנטורציה על ידי חימום ב-90 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות והופרד על ידי 12% SDS-PAGE.הג'ל מקובע ומוכתם בתמיסת Coomassie Brilliant Blue (40% מתנול, 10% חומצה אצטית, 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250), מופרע בצבע ונחשף למסך הדמיה זרחני למשך 20 שעות (כדי לזהות nsp12 מ-NMPylation) או (מקסימום) 2 שעות (כדי להעריך nsp9 NMPylation).נעשה שימוש במכשיר תדמית מסוג Typhoon 9200 (GE Healthcare) כדי לסרוק את המסך ו-ImageJ שימש לניתוח עוצמת האות.
לניתוח טרשת נפוצה, נעשה שימוש ב-1 µM nsp12-His6 ו-10 µM nsp9 (ללא תג hexahistidine) בניתוח NMPylation (נספח SI, טבלה S1) והשימוש בריכוז המוגבר של 500 µM UTP ו- GTP.בהתאם לריכוז שלהם ולאיכות החלבון הצפויה, מערכת Waters ACQUITY H-Class HPLC מצוידת בעמודת MassPrep (Waters) שימשה להמלחת 1 עד 10 μL של תמיסות חלבון מוגפות באינטרנט.החלבון המותפל נחלץ למקור יוני האלקטרונית של ספקטרומטר המסה Synapt G2Si (Waters) דרך השיפוע הבא של חיץ A (מים/0.05% חומצה פורמית) ומאגר B (אצטוניטריל/0.045% חומצה פורמית), וטמפרטורת העמודה היא 60 מעלות צלזיוס וקצב זרימה של 0.1 מ"ל לדקה: אלוציה איזוקרטית עם 5% A למשך 2 דקות, ולאחר מכן שיפוע ליניארי ל-95% B תוך 8 דקות, ושמור על 95% B למשך 4 דקות נוספות.
מתגלים יונים חיוביים עם טווח מסה של 500 עד 5000 m/z.Glu-fibrinopeptide B נמדד כל 45 שניות לתיקון סחף מסה אוטומטי.השתמש בתוכנת מכשיר MassLynx עם סיומת MaxEnt1 כדי לפרק את הספקטרום הממוצע לאחר ניכוי קו הבסיס והחלקה.
UMPylated HCoV-229E nsp9 עוכל על ידי הוספת טריפסין שונה בדרגת רצף (Serva) והודגרה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס.עמודת ספין Chromabond C18WP (מספר חלק 730522; Macherey-Nagel) שימשה להמלחה ולריכוז הפפטידים.לבסוף, הפפטיד הומס ב-25 μL מים, שהכילו 5% אצטוטריל ו-0.1% חומצה פורמית.
הדגימות נותחו על ידי MS באמצעות ספקטרומטר מסה Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).מערכת HPLC הננואה האולטימטיבית (Dionex), מצוידת בקצה מותאם אישית 50 ס"מ??עמודה 75 מיקרומטר C18 RP עמוסה בחרוזים מגנטיים בגודל 2.4 מיקרומטר (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) התחבר לספקטרומטר המסה באופן מקוון דרך מקור ננוספריי Proxeon;להזריק 6 μL של תמיסת עיכול טריפסין לקוטר פנימי של 300 מיקרון ×??1 ס"מ C18 PepMap טור ריכוז מראש (Thermo Scientific).באמצעות מים/0.05% חומצה פורמית כממס, הדגימה נלכדה והופלה אוטומטית בקצב זרימה של 6 μL/דקה.
ההדרגות הבאות של מים/0.05% חומצה פורמית (ממס A) ו-80% אצטוניטריל/0.045% חומצה פורמית (ממס B) שימשו להשגת הפרדה של פפטידים טריפטיים בקצב זרימה של 300 nL/min: 4% B עבור 5 דקות, ואז שיפוע ליניארי של 30 A ל-45% B תוך דקות, ועלייה ליניארית ל-95% ממס B תוך 5 דקות.חברו את העמודה הכרומטוגרפית לננו-פולט נירוסטה (Proxeon), ורססו את ה-eluent ישירות לנימים המחומם של ספקטרומטר המסה באמצעות פוטנציאל של 2,300 V. סריקת הסקר ברזולוציה של 60,000 במנתח המסה Orbitrap משויכת עם לפחות שלוש סריקות MS/MS של נתונים, שלא נכללו באופן דינמי למשך 30 שניות, תוך שימוש בדיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות של מלכודת יונים ליניארית או ניתוק התנגשות באנרגיה גבוהה יותר בשילוב עם זיהוי מסלול , הרזולוציה היא 7,500.
זמן פרסום: אוגוסט-03-2021